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研究生中文姓名:蕭敬達
研究生英文姓名:Hsiao, Ching-Ta
中文論文名稱:法夫酵母2-Cys peroxiredoxin基因選殖及表現之研究
英文論文名稱:Cloning and expression of 2-Cys peroxiredoxin from Xanthophyllomyces dendrorhous
指導教授姓名:林棋財
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:生命科學暨生物科技學系
學號:10336022
請選擇論文與海洋研究相關度:無相關
請選擇論文為:學術型
畢業年度:105
畢業學年度:104
學期:
語文別:中文
論文頁數:35
中文關鍵詞:法夫酵母過氧化氫酶
英文關鍵字:Xanthophyllomyces dendrorhousperoxiredoxinexpression
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Peroxiredoxin是ㄧ類過氧化酶 (peroxidase) ,屬於抗氧化蛋白,廣泛存在於原核和真核生物中。Prx蛋白的N-端都具有保守的Cys殘基,依據Cys殘基的數目以及保守性分為1-Cys Prx和2-Cys Prx。Peroxiredoxin的目的是將過氧化氫還原成氧化氫,可見Prx是一個很重要的抗氧化酵素。以不同物種來設計Prx之胺基酸序列保守區域設計引子,再利用聚合酶連鎖反應,從法夫酵母菌cDNA庫中選殖出2-Cys peroxiredoxin (簡稱XdPrx) 之全長 cDNA序列,全長大小為 942 bp,而轉譯區為 600 bp,可以譯出 199 個胺基酸,預測分子質量約為22 kDa。XdPrx 以pET-20b(+) 作為表現載體,以E.coli C43 (DE3) 作為表現宿主,經由1mM IPTG 誘導20 ml 的培養液,即可表現出XdPrx。以含有鎳螯合物凝膠 (nickel chelating sepharose) 之親合性管柱進行親合型結合來純化目標蛋白,其分子質量約為 50 kDa 推測為雙倍體。之後以ferrithiocyanate assay測定其活性,測得的蛋白活性不穩定,在 60℃下熱失活常數 (kd) 為 9.62x10-2 min-1,半衰期約為3 min。
One type of peroxidases was peroxiredoxin, exist in prokaryotes and eukaryotes. Peroxiredoxin has conservative cysteine residue at the N-terminal portion. Peroxiredoxin provided the protective antioxidant by reducing hydrogen peroxide to H2O. Peroxiredoxins play important roles in antioxidation. cDNA of 942 base pairs containing a complete open reading coding 198 amino acid residues encoding a putative Prx (named XdPrx) was cloned from Xanthophyllomyces dendrorhous. The molecular mass was predicted 22 kDa. The deduced protein showed high level of sequence homology when aligned with Prx from other organisms. The coding region of XdPrx cDNA from Xanthophyllomyces dendrorhous was introduced into an expression vector, pET-20b(+), and transformed into Escbericbia coli CK3(DE3). The recombinant 6His-tag XdPrx was expressed and purified by Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharose column. The enzyme has a half-life of 3 min at 60 °C and kd value is 9.62x10-2 min-1.
目錄
謝辭 i
摘要 ii
Abstract iii
縮寫表 iv
目錄 v
壹、前言 1
一、Xanthophyllomyces dendrorhous 1
二、Peroxiredoxins的分類 1
三、Peroxiredoxins的起源 1
四、Peroxiredoxins的作用 2
五、研究動機 3
貳、實驗材料 4
一、真菌、質體及微生物材料 4
(一) 真菌材料: 4
(二) 質體材料: 4
(三) 微生物材料: 4
二、培養基 5
三、套組 5
四、標準品 5
五、儀器設備 5
六、實驗藥品 6
(一) 酵素 6
(二) 緩衝液 6
(三) 培養基添加物 6
(四) 染劑 7
(五) 蛋白質電泳及純化相關藥品 7
(六) 活性染色相關藥品 7
(七) 其他 7
七、實驗耗材 8
八、引子 8
參、實驗方法 9
一、XdPrx基因選殖 9
(一) 片段選殖 9
(二) DNA電泳分析方法 10
(三) 目標DNA純化 10
(四) 目標DNA選殖載體之建構與序列確認 10
(五) XdPrx全長序列 11
二、XdPrx之蛋白質表現 11
(一) 表現載體之構築 11
大腸桿菌表現載體 11
(二) 重組表現質體之轉形作用 12
1.抽取質體DNA 12
2.大腸桿菌勝任細胞之製備 13
3.大腸桿菌之轉型作用 13
(三) XdPrx蛋白質誘導表現、純化及電泳分析 14
1. XdPrx於大腸桿菌之誘導表現 14
2.親和性管柱層析 14
3.聚丙烯醯胺電泳分析 14
(四) XdPrx純化後之透析 15
三、XdPrx之特性分析 16
(一) 蛋白質的濃度測定 16
(二) XdPrx活性測定 16
(三) 蛋白質分子特性分析 16
熱穩定性 16
肆、結果 17
一、XdPrx之基因選殖 17
(一) 5' RACE與3' RACE XdPrx cDNA選殖 17
(二) XdPrx全長 17
二、XdPrx之生物資訊分析與3-D結構模擬 17
(一) 生物資訊分析 17
(二) 3-D結構模擬 18
三、XdPrx之表現與純化 18
(一) 建構表現載體 18
(二) 重組XdPrx的誘導表現及純化 18
大腸桿菌之表現及純化 18
四、重組XdPrc之特性分析 19
熱穩定性 19
伍、討論 20
陸、參考文獻 21
圖表 23
Appendix 32

參考文獻
廖怡珍,2006,樟芝 2-Cys peroxiredoxin 之基因選殖及特性分析,國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文

劉家愷,2015,法夫酵母錳型超氧歧化酶基因選殖、表現及其性質之研究,國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文

潘俊深,2014,紫紅硬孔菌多功能木質素過氧化酶之基因選殖及蛋白質表現,國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文

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全文檔開放日期:2019/07/11
 
 
 
 
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